为什么开展荧光Western Blotting？

概述

     荧光western blotting（WB）检测系统越来越受欢迎，因为与化学发光或显色检测系统相比，它在化学发光检测方面节省了更多的时间，减少了化学废物。过去，荧光Western Blot由于检测灵敏度或检测仪器过于昂贵而令人望而却步。随着新型荧光探针的开发，成像技术的进步，以及两者成本的降低，荧光WB正在迅速取代许多实验室的显色和化学发光检测方法。虽然荧光检测限还没有化学发光检测那么低，但荧光检测具有独特的优点，可以在同一印迹上同时检测多个目标，而不需要剥离和重新孵育。

图1 化学发光western blot检测原理示意图

图2 荧光western blot检测原理示意图

       在荧光western blot检测系统中，信号以光的形式捕获。荧光基团发出的瞬态光是由被激发的分子返回其正常状态时光子的激发和随后的释放而产生的。相比之下，显色和化学发光的western检测系统产生的信号是酶-底物反应的产物。显色酶-底物反应产生沉淀到膜上的有色产物，而化学发光检测系统产生以光的形式释放能量的酶反应。荧光应用可以比酶系统更定量。与酶反应类似，荧光试剂必须根据信噪比进行优化。如果荧光标记的程度过低，信号就会变弱。然而，如果荧光标记的程度过高，信号也会因为检测试剂的失活或信号的猝灭而变得微弱，这一现象被称为荧光共振能量传递(Forster resonance energy transfer, FRET)。与荧光显微镜一样，必须小心选择经过荧光验证的支撑或基质材料。典型的印迹膜，如硝基纤维素和聚偏二氟乙烯(PVDF)，已知具有荧光性质，可导致显着的背景时，使用荧光western印迹。然而，用于荧光检测的试剂的激发波长和发射波长都是为了避免普通膜的自发荧光而选择的。特殊的低荧光膜也可用于荧光western blots。

荧光WB检测的优点

    荧光法使多重western blot分析成为可能，在同一blot上可以同时检测和分化多个蛋白质。例如，可以通过与荧光染料结合的二抗来检测两到三种不同的蛋白质，这种荧光染料的荧光波长不同。二抗偶联物与荧光染料Alexa Fluor被设计用于多种多样的荧光蛋白和细胞分析免疫分析方法，包括多种western检测。与基于酶的化学发光底物检测相比，荧光western blot检测除了能实现多路复用外，还有其他几个优点:

Ø  能够在同一时间测定同一斑点上的多个目标

Ø  在查看多个目标时，不需要剥离和重新探测污点

Ø  无需担心底物的孵育时间或胶片曝光

Ø  节省时间，保存样品

Ø  提供可靠的定量数据

量子点荧光WB

    量子点（quantum dot，简称QDs）作为一种新型荧光纳米晶，具有一些独特的荧光性能，如荧光发射波长可控、发射峰狭窄对称、激发波长范围广、量子效率高、光稳定性好等，量子点的上述荧光特性为制备高灵敏度的免疫荧光探针提供了很好的选择。

    量子点Western Blot技术具有灵敏、可定量、多元检测等特点，早在2005年Ornberg等报道了量子点荧光技术在Western Blot分析中的应用；同年，Bakalova等报道了利用生物素-亲和素信号放大的超灵敏Western Blot技术，与传统的量子点标记物比较，生物素-亲和素放大后的量子点Western Blot检测灵敏度提高5倍，但上述生物素-亲和素方法需要额外的孵育步骤，实验步骤也更复杂。胥传来等利用生物素-亲和素的特异性结合反应，将量子点团聚制备得到亲和素化的多聚量子点，然后与膜上的生物素化一抗结合，其对蛋白的检测线性范围为30-1500 pg；然而生物素-亲和素制备的多聚量子点步骤较复杂且保质期较短，且需要生物素化的一抗，因而在Western Blot的应用中受限制较多。

    尽管目前关于量子点在Western Blot检测中的应用有较多的报道，但量子点免疫荧光探针在对非常微量的蛋白进行检测时，还存在信号低，噪音干扰大等问题。因此对目前的量子点免疫荧光探针制备方法进行改进，提高检测的灵敏度、稳定性和易操作性是目前分析检测领域迫切的需求。且目前关于量子点在Western Blot检测中的应用也较少与实验室常用的化学发光显色方法进行平行比较。

与现有的技术相比较，本发明具有以下优点：

Ø  检测灵敏度更高、信号检测时无需额外的信号放大步骤、量子点纳米球荧光二抗保质期更持久等特点。

Ø  无需发光底物、检测信号更稳定可长期保存、结果的一致性和可重复性等特点。

Ø  荧光信号更稳定、无需避光操作、无需特殊的近红外激光扫描仪检测等特点。

                          图3 化学发光（ECL）与量子点荧光（QBC）检测Hela细胞中内参蛋白GAPDH的结果比较。

（从左至右各泳道总蛋白上样量，5,10,15,20,25,30μg）

                             图4 化学发光（ECL）与量子点荧光（QBC）检测Hela细胞中内参蛋白Tubulin的结果比较。

（从左至右各泳道总蛋白上样量，5,10,15,20,25,30μg）

荧光western blotting检测仪器

       荧光western blotting的结果需要特殊的仪器检测，即一种荧光成像仪器。一些制造商提供荧光成像仪器，其中大多数使用激光或基于led的照明与滤波器的组合，以提供适当的激发光波长，然后捕获适当的发射光输出。多数仪器使用专门的CCD相机来捕捉信号，得到的数据是数字化的结果。

       具有不同激发和发射光谱特性的荧光染料的种类不断增加。具有非重叠光谱的荧光团可以进行多重分析，从而在同一泳道和同一印迹膜上检测到两个或三个不同的目标蛋白，并进行独立识别。然而，成像仪器必须配备一套适当的激发和发射滤波器，以解决产生的荧光信号。一些仪器专门用于检测红外和近红外荧光体，而另一些仪器则用于分析可见范围内的多种荧光染料。越来越多的现代仪器可以结合荧光成像在可见光和近红外/红外范围。

       量子点具有较宽的激发光谱，不同发光波长的可以用一个光源同时激发产生不同颜色荧光，这是传统有机荧光材料所不具有的特点；具有较高的荧光发光效率，量子点检测不必限定在近红外区域就可以达到较高的检测灵敏度，一般紫外光可以激发量子点产生较强的荧光。量子点优异的光学性能，是的量子点荧光WB的检测仪器大大简化。一般生物实验室常用的“紫外凝胶成像仪”就可以满足检测要求，大大降低了荧光WB技术的实际应用场景。

  图5 不同荧光成像仪量子点WB检测结果的比较